Estas gentes no explotaron los recursos y numerosos pobladores vendieron sus propiedades para regresar a sus lugares de origen, dando lugar a una segunda repoblación impulsada por los reyes, señores jurisdiccionales y concejos municipales en los siglos XIV y XV.

Fue el Duque de Medinasidonia Don Juan de Guzmán y su hijo Don Enrique de Guzmán, quienes atrajeron pobladores, concediéndoles privilegios y ventajas para hacer casas y asientos de población, y así consolidar su patrimonio y sacar rendimiento a su señorío. Estas migraciones interiores que tenían como destino la Villa continuaron dándose a lo largo de la Edad Moderna.

San Juan del Puerto se constituyó como importante encrucijada de caminos, por donde los productos del interior, Extremadura, la Sierra y el Condado, accedían al mar por el puerto de San Juan o la Ría de Huelva.

Su situación geográfica, en una de las orillas del Río Tinto, propició que alguno de los marineros residentes en el pueblo participasen en los viajes organizados por Cristóbal Colón al Nuevo Mundo. El 25 de septiembre de 1493 partía con Colón el marinero Mateo de Morales, vecino de ésta Villa, en el segundo viaje, del mismo modo Alonso de la Calle siguió sus pasos en 1502, en el cuarto viaje y fueron los precursores de una emigración posterior que llevó a tierras americanas muchos naturales de esta Villa.

A lo largo de los siglos siguientes, hasta bien entrado el año 1700, la Villa sanjuanera es el enclave de importación y exportación de todos los productos del contorno, compitiendo con los puertos de la margen izquierda de los ríos Tinto y Odiel. Esto ocasionó dificultades sobre todo en las artes de pesca de bajura y altura, entablándose numerosos conflictos y contenciosos entre las poblaciones vecinas.

En el siglo XVI la expansión de Andalucía Occidental hizo de San Juan del Puerto un núcleo próspero y de gran actividad, superando a núcleos anteriores como Ayamonte, Palos, Gibraleón y Moguer, y a finales del siglo ya rivalizaba con el puerto de Huelva.

Dos siglos de transformaciones históricas hacen olvidar el pasado naviero y la importancia que el puerto tuvo en la Edad Moderna, como elocuente testimonio de unas transformaciones económicas y vitales que terminaron afectando a todos los núcleos portuarios del Río Tinto.